Improvement of heterologous production of ricinoleic acidin the yeast Yarrowia lipolytica : Metabolic engineering andenzymatic engineering on membrane-bound desaturases
Améliorer la production hétérologue d'acide ricinoléique chez la levure Yarrowia lipolytica : Ingénierie métabolique et ingénierie enzymatique sur la famille des désaturases membranaires
Résumé
Ricinoleic acid is an unusual hydroxylated fatty acid from plant that has many applications. Its demand continues to grow but the cultivation of the tropical plant that produces it is stagnating. Overexpression of a CpFAH12 fungus hydroxylase in an engineered Yarrowia lipolytica yeast strain has resulted in heterologous production of this molecule of interest but in insufficient quantity to be an alternative production method. The aim of my thesis was to increase the ricinoleic acid production in the previously constructed strain.In a first part of my work, a new “extractive-fermentation"-like method was developed to reduce the variability of the ricinoleic acid production. The presence of an organic phase had a positive effect on both the physiological state of the cells and on the variability of the fatty acid concentrations measurements. A strain allowing targeted integrations of expression cassettes was also constructed, which improved reproducibility between experiments.Two strategies were then followed for the improvement of ricinoleic acid production. The first one revolves around the understanding of the determinants of the desaturation / hydroxylation specificity for the bifunctional hydroxylase from the fungus Claviceps purpurea, CpFAH12. The construction of chimeras and mutants by comparison with a homolog that has only desaturation activity and the creation of hydroxylase model allow us to make hypotheses on the determinants, but no improvement of the hydroxylation rate were obtained.The second strategy is the modification of the lipid metabolism of Y. lipolytica. The reaction of hydroxylation takes place on an oleic acid esterified on a phosphatidylcholine. Two strategies, the increase of the substrate pool and the promotion of product release were tested. Both strategies show interesting results that remain to be confirmed. The latter, however, seems the most promising since overexpression of Yl.TGL5 led to an improvement of almost 50% in ricinoleic acid production.Finally, a last attempt was the expression of a monofunctional hydroxylase such as the hydroxylase of castor plant, RcFAH12. But its expression, as well as those of other plant enzymes (conjugases and epoxidases), did not lead to a significant production of unusual fatty acids. Therefore, we have used chimera approaches to understand the reasons for the non-functionality of these plant enzymes in yeast. We were able to show that the problem was not related to the enzyme integration into the membrane. Other hypotheses have yet to be investigated to determine the limiting factors, like the interactions between plant desaturases and the membrane-chain of electron-transport.
L’acide ricinoléique est un acide gras hydroxylé inhabituel d’origine végétale qui possède de nombreuses applications. Sa demande ne cesse de croître et la culture de la plante tropicale qui produit cette huile plafonne. La surexpression d’une hydroxylase de champignon CpFAH12 dans une souche ingénierée de la levure oléagineuse Yarrowia lipolytica a permis de produire de façon hétérologue cette molécule d’intérêt mais en quantité insuffisante pour en faire une voie de production alternative. L’objectif de ces travaux de thèse était d’augmenter la production en acide ricinoléique de la souche précédemment utilisée.Dans une première partie de ma thèse, une nouvelle méthode de production de type « fermentation extractive » a été développée pour réduire la variabilité de la production d’acide ricinoléique. La présence d’une phase organique a eu un effet positif sur l’état physiologique des cellules et sur la variabilité des concentrations en acides gras mesurées. Une souche permettant une intégration ciblée des cassettes d’expression a également été construite et a permis d’améliorer la reproductibilité entre les expériences.Deux stratégies ont alors été suivies pour l’amélioration de la production d’acide ricinoléique. La première porte sur la compréhension des déterminants de la spécificité désaturation/hydroxylation de l’hydroxylase bifonctionnelle du champignon Claviceps purpurea, CpFAH12. La construction de chimères et de mutants par comparaison avec un homologue ne présentant qu’une activité de désaturation et la création d’un modèle tridimensionnel de l’hydroxylase ont permis d’identifier un acide aminé clef pour la spécificité enzymatique, mais aucune amélioration du taux d’hydroxylation n’a été obtenue.La seconde stratégie est la modification du métabolisme lipidique de Y. lipolytica. La réaction d’hydroxylation a pour substrat un acide oléique estérifié sur une phosphatidylcholine. Deux stratégies visant à augmenter le pool de substrat et à favoriser la libération du produit ont été testées. Toutes deux montrent des résultats intéressants qui restent à confirmer. La dernière semble toutefois la plus prometteuse puisque la surexpression de Yl.TGL5 semble avoir permis une amélioration de près de 50% de la production d’acide ricinoléique.Enfin, une dernière voie a été testée, l’expression d’une hydroxylase monofonctionnelle comme l’hydroxylase du ricin, RcFAH12. Mais son expression, ainsi que celle d’autres enzymes de plantes (conjugases et époxydases), n’a pas permis d’obtenir une activité significative. Nous avons donc, par des approches de chimères, tenté de comprendre quelles étaient les raisons de la non-fonctionnalité de ces enzymes de plantes chez la levure. Il a été possible de montrer que le problème n’était pas lié à l’intégration dans la membrane. D’autres hypothèses restent à creuser pour déterminer quel est le facteur limitant, comme les interactions avec les enzymes de la chaîne membranaire de transport d’électron.
Origine : Version validée par le jury (STAR)
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